干细胞在异种动物体内的移植技术

2016-11-075980点击

来源：科技日报

干细胞移植是一种对多种疾病有效的治疗方法，但是对于干细胞移植后在体内的生物学行为所知甚少，使其临床应用在目前仍受到相当的限制。宫内移植是近年来发展起来的一种干细胞移植技术，它将移植的时间推前到胎儿时期，由于胎儿早期的免疫系统尚未发育成熟，因此对移植的外源细胞产生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后进行免疫移植治疗。干细胞宫内移植作为一种新的产前治疗手段，对一些目前难以根治的先天性/遗传性疾病的治疗提供了一种新的手段。

干细胞移植是一种对多种疾病有效的治疗方法，但是对于干细胞移植后在体内的生物学行为所知甚少，特别是由于难以寻找到合适配型的供者、移植后常出现的宿主抗移植物反应和需长期进行免疫抑制治疗等问题，使其临床应用在目前仍受到相当的限制。宫内移植是近年来发展起来的一种干细胞移植技术，它将移植的时间推前到胎儿时期，由于胎儿早期的免疫系统尚未发育成熟，因此对移植的外源细胞产生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后进行免疫移植治疗。干细胞宫内移植作为一种新的产前治疗手段，对一些目前难以根治的先天性/遗传性疾病的治疗提供了一种新的手段，此外，通过干细胞宫内移植技术构建人/动物嵌合体对深入研究人干细胞在体内的归巢、分化、基因表达特征、可塑性和组织损伤的修复等提供了新的思路和良好的模型。本成果开展了以下几个方面的工作：

简要技术

1.在B－超监视下，通过人源干细胞宫内移植途径进行了大规模的人/山羊异种移植嵌合体的研制，首次建立了人/山羊嵌合体动物模型，在B超监视和引导下，将来源于人脐带血CD34＋Lin－细胞注射到孕期为45—65天的胎山羊腹中，定期用B超观察胎羊的生长发育情况，并观察母羊的生理反应和免疫耐受情况。胎羊出生后，综合应用分子生物学、分子细胞遗传学、细胞生物学、免疫组织化学等技术证明人源干细胞可在山羊体内长期存活，目前已获得32头嵌合体山羊，人源细胞在山羊体内存活的最长时间已达2年以上。

2.开展了嵌合体山羊体内人源细胞多器官移植存活、分化和基因表达特征的研究。为探讨宫内移植的人源干细胞在山羊体内的分布和分化情况，构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因反转录病毒载体并将其转导到人造血干细胞中（GFP+细胞），进行山羊宫内移植获得人/山羊嵌合体，然后综合应用FACS、PCR、实时定量PCR、RT－PCR、FISH和免疫组化等方法在人/山羊嵌合体活体水平追踪和观察人源细胞的体内行为特征。结果显示，人源干细胞在山羊的血液、肝、肾、肌肉、肺等器官高比例的归巢并分化成相应的人的组织细胞（如人肝样细胞，表达人血清白蛋白、人肝细胞特异抗原和人肝核因子等），显示了广泛的可塑性。

3.开展了干细胞可塑性机制的研究。应用流式细胞仪分选经灌流的嵌合体山羊肝脏中的人源细胞(GFP+细胞)，经过分子生物学技术鉴定，证明存在于山羊体内的GFP+细胞确实是人细胞；表明移植于山羊体内的人源干细胞的可塑性并非由细胞融合机制所致。

4.应用基因芯片分析了人/山羊嵌合体中人源基因的表达谱。应用AffymetrixU133A基因芯片系统地分析了嵌合体山羊血液和肝脏组织人源基因表达谱，结果显示在血液和肝脏中分别有133种和86种人源基因（包括信号传导、膜和受体蛋白以及转录因子等不同类别的基因）高度表达，这一结果经实时定量RT-PCR和/或DNA测序证实，从而为检测来源自人造血干细胞的活细胞在体内的基因表达特征提供了一种新的特异的标记。

5.构建了更昔洛韦（GCV）可诱导的转HSV－tk基因小鼠肝损伤动物模型和异体或异种移植嵌合体小鼠模型，活体水平证明造血干细胞宫内移植可有效的修复肝损伤，构建了转HSV－tk基因小鼠肝损伤物动模型，然后在胎鼠妊娠12天时通过宫内移植干细胞的技术获得具有异体或异种（人）细胞的嵌合体小鼠模型，小鼠出生后利用GCV诱导特异肝损伤，并通过血液生化，肝脏免疫组织化学，分子检测等分析外源干细胞在受体肝脏的增殖与对肝损伤修复情况，结果显示，大部分宫内移植阳性鼠在GCV处理后，血清生化学指标，如AST，ALT和ALP等没有明显改变，损伤28天后通过肝脏病理学分析也证实移植鼠肝结构基本正常，未见灶性坏死，炎性细胞浸润增生等肝脏损伤组织病理形态学变化，PCR结果表明肝脏存在供体细胞。异种异体嵌合模型的RT－PCR和免疫组织化学结果也显示有相应人源肝脏特异基因的mRNA表达和肝特异蛋白的存在，提示宫内注射的供体细胞在损伤条件下可能归巢到肝脏并在肝脏增殖，参与损伤肝的修复和再生，从而对肝损伤有保护效果。