细胞产品可以被认为是一群由功能成分(有活性的细胞)和污染物成分组成的杂合细胞群体。污染物有可能是辅助细胞、未分化细胞或者其它与治疗作用无关的细胞。生产工艺需要确保各批次之间包括稳定数量的活性成分和污染成分。

       以下将详细探讨细胞产品中存在的不需要的细胞组分以及确定这些组分的可接受水平的重要性。对细胞产品进行功能评估需要开发检测产品功效的模拟系统，以此来预测细胞产品的体内活性。这种分析测试系统有可能十分复杂，因为活细胞的类型或者其发挥活性的机制无法知晓(如在脊髓损伤治疗中，治疗性细胞有可能是促进髓鞘再生，或者是提供了某些生长因子或者两者都具备)。开发体外预测分析系统可以大大减少测试和优化生产条件所需的成本和时间，从而可以大大的促进生产。

       对某个终产品的特征进行鉴定需要考虑细胞群体和其发挥功能的机制。比如，在对治疗帕金森氏病(Parkinson’s disease)中用作替代细胞的多巴胺能神经元(dopamainergic neurons)进行鉴定时，需要考虑的问题是，该细胞群需要表达合适的标记分子如神经丝和酪氨酸羟化酶(neurofilament and tyrosine hydroxylase)，不表达未分化细胞、内胚层和中胚层的标记分子。功能测试项目中应该包括细胞去极化后多巴胺的释放活性和移植后不分裂特性的维持。再比如，如果移植的细胞主要是为了提供某些因子以保护内源性细胞或者弥补内源性缺失的因子，那么功能分测试项目中就需要分析这些因子的分泌情况。

       在细胞产品的评估中，表观遗传学特征分析(epigenetic profiles)也有可能起到一定的作用。目前，FDA还没有对一些细胞产品中重要基因的表达检测或者表观遗传组学(epigenome)的检测做出要求。即便如此，如果对这些指标进行检测将会有利于细胞特征的评估。刚开始的时候可以检测组蛋白修饰(histone modification)和DNA甲基化(DNAmethyaltion) [21,22]，以此来评估表观遗传的稳定性。

       确定细胞产品的均一性的困难是客观存在的，因为多能干细胞正是由于其多潜能性才在临床治疗方面受到人们青睐的。多能干细胞是一种活跃的细胞，能够对环境作出积极的反应。在培养条件下可以进行无限生长，从而导致了以体外系统很好地预测以多能干细胞为基础开发出的某种细胞产品批次间的稳定性、体内活性面临巨大的挑战性。由iPSCs所展开的个性化治疗研究，每个批次的细胞产品都是个体特异性的，每个批次产品的起始材料都不同，这又一次加剧了产品均一性评估的难度。尽管如此，还是开发出了一些方法来检验并监测这些参数。

3. 细胞的稳定性

       细胞治疗领域的细胞稳定性议题起源于对细胞群体的分割。人们尤其关心的是细胞在经历若干群体倍增(population doublings)后是否变得不稳定或者发生转变。确实，造血细胞移植(目前唯一大规模使用的干细胞治疗方法)治疗中偶尔会发生的一种并发症就是供体细胞白血病(donor-cell leukemia ) [23]。细胞在体外进行长时间培养后就会开始发生漂变或者说是发生遗传性或者表观遗传性变化。

       自我更新能力增强的hESCs有可能在体外长期培养条件下获得选择优势。在某些情况下，长期培养条件下的hESCs明显具备一种稳定的表型、核型和印记特征[24-28]，但是在另一些情况下，它们也可能获得与人类胚胎瘤类似的核型特征，比如12号染色体三体和17号染色体三体[26], 或者其他变异[29]。有两个研究小组最近在长期培养的hESCs中鉴定出了一些次生的染色体异常，包括与癌基因转变有关的20q11.21扩增[30,31]。总体上，这些细胞还是保持了多能性特征并表达一些标准的hESC标记[25,26, 32]。尽管还不知道存在于hESC培养中的少数核型异常细胞是否会影响包括生长速度、细胞周期调控和分化能力在内的大体特征，但是，这些异常的发现强调了细致监测的必要性。开发出异常核型检测方法将会对安全性评估起到很好的辅助作用。

       由于采用了人类胚胎这种特殊的起始材料，对hESCs表观遗传的稳定性在一开始就引起了人们的注意。已经发现人工辅助生殖用的培养胚胎存在着一些表观遗传异常[33,34]。有几个研究小组已经着手对hESCs的表观遗传学特征进行研究，包括X染色体失活(X-inactivation)、印记(impringting)和甲基化(methylation)。X染色体失活似乎在不同的hESCs细胞系中存在着差异[35,36]。印记研究表明在培养环境下可以维持基因组一定程度上的稳定性[27,28, 33]。一些新的工具已经被开发出来评估多能干细胞的甲基化特征[37,38]。接下来的工作就是研究这些甲基化特征能否在长期培养下保持稳定。

       考虑培养的hESCs的遗传学和表观遗传学问题对安全性测试具有多方面的启示。其中最重要的一点就是对hESCs和分化出来的细胞产品的测试需要在一个足够长的时间范围内进行，这样才可以获得关于稳定性的可靠结论。所以，上文提到的对产品稳定性进行测试的的指标(表型、核型、遗传特征和表观遗传特征)都需要在一个长的时间期限内进行。对囊括数代或者数个倍增群体进行的稳定性测试可以包括重要基因的表达(如端粒酶基因、细胞周期相关基因、关键的hESC标记分子基因)、基因组和表观遗传的稳定性(甲基化、miRNA、组蛋白乙酰化和X染色体失活)。将这些测试与对其它体外分析测试相结合，有可能使遗传学和表观遗传学特征测试成为细胞产品体内稳定性评估的一种测试方法。

       虽然我们相信细胞治疗所采用的hESC群体应当是二倍体并且稳定，但是值得指出的是，在FDA批准的临床试验中，有用人类胚胎瘤细胞系NT2进行试验的项目[39,40]。在由Layton Bioscience公司(美国加州光谷)所实施的临床试验中，所移植的神经元细胞来源于NT2/D1细胞系。NT2/D1细胞先在视黄酸条件下培养6周，然后在抗有丝分裂物质下培养6天，然后将按照这种培养方法所生产出来的神经元细胞冷冻保存直到移植。移植时，细胞被解冻，然后经过一定的处理后注射到中风病人的体内。病人在接受大约两百万到一千万细胞移植后，还需要进行持续52周的移植后评估。NT2细胞被报道有56-61条染色体，并携带很多异常[41]。但是，当将NT2N细胞(对这种细胞的处理方法与上述应用于临床应用的细胞的处理方法相似)移植到裸鼠中枢神经系统时，在14个月的检测期内没有发现致瘤性和有丝分裂活性[42]。另外，在这些临床试验中，没有一例致瘤的报道。这些数据表明，异常核型或者较轻微的异常倍型不是致瘤性的预测指标。

参考文献（略）

原文作者：Melissa KCarpenter, Joyce Frey-Vasconcell and Mahendra S Rao

原文检索：Carpenter, M.K., J. Frey-Vasconcells, and M.S. Rao, Developing safe therapiesfrom human pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2009. 27(7): p. 606-613

翻译：何君贤

出处：《干细胞者说》